圣约翰大教堂（St. John’s Co-Cathedral）是以圣约翰骑士团的守护神命名，由设计总统府的著名建筑师卡萨尔设计的。教堂始建于1573年，是骑士团首领拉·卡西尔为使瓦莱塔能够完全取代当时的首都伯尔古，并由其本人出资兴建的。1578年教堂建成，标志着骑士团由伯尔古迁都到瓦莱塔的正式完成。18世纪时进行了扩建。
教堂呈早期巴洛克建筑风格，部分摹仿了哥特式建筑风格。教堂整个圆顶是一副大壁画，由意大利画家马迪亚·布雷迪所画，表现了圣约翰的生平故事。大理石地面上刻着下面埋着的出身高贵的骑士的名字，第一任首领阿达姆和第六任首领瓦莱特的遗体就埋放在教堂的地下墓穴里。大教堂内部又分小礼拜堂，分归骑士团的“八语”骑士（骑士来自法、德、西、意、英、葡等六国，当时法国骑士来自三地，所操语言不同，按语言分支）供奉自己的守护神。小礼拜堂内葬着本语骑士团首领的遗体。在过去，逢盛大节日，小礼拜堂前挂有做工精美的比利时挂毯，挂毯取材于名画，内容表现耶稣的生平。
圣约翰大教堂是骑士团自己的教堂，也是最主要的教堂，是首领和骑士举行重大宗教仪式和祭祀的场所，从教堂的装饰可以了解骑士团的历史。教堂外观苍白、朴素，但内部装饰却丰富多彩。据说，圣约翰大教堂是基督教世界最奇妙最吸引人的教堂之一。教堂博物馆（原祈祷堂）内有一副世界名画《被砍头的圣约翰》，其突出特点是强烈的明暗对比画技和现实主义的人物造型相结合。这是意大利画家卡拉瓦乔的作品。他于1608年来马时应骑士团首领之请而绘成。
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